經典實驗步驟是將提取的蛋白電泳—轉膜 --- 一抗孵育 --- 二抗孵育 --- 底物顯色 --- 分析。我這幾天幾乎都在重復著這個過程，現在將自己試驗過程記錄下來，和大家一起分享，希望對新手有所幫助。

1.蛋白提取

     傳統方法是(1)組織稱重(2) 利用液氮、研缽粉碎組織塊(3) 加入RIPA緩沖液，PMSF(4)勻漿（15,000轉/分*1分鐘）維持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分鐘，移入離心管4℃ 離心15分鐘(6)上清液為細胞裂解液可分裝-20℃保存。一部分進行Bradford比色法 測定蛋白質濃度， 取相同質量的細胞裂解液（體積*蛋白質濃度）進行電泳。

    小結 現在有許多公司提供即用的蛋白提取試劑或者試劑盒，如生興生物 代理的Pierce系列產品，針對不同動物組織、真核等蛋白的提取試劑盒，以及RIPA緩沖液，PMSF等即用型試劑，免去了復雜繁瑣的提取過程，高效方便。

2. 蛋白電泳(SDS-PAGE)

(1) SDS-PAGE凝膠配制

    SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用現成的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

(2) 樣品處理

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2X或5X的)。可以自行配制。

(3) 上樣與電泳

    這一步主要是要注意電泳的電壓選擇和蛋白標準的選擇，為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準 。

3. 轉膜

    具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。實驗中常選用PVDF膜和硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，推薦使用PVDF膜。轉膜的效果用麗春紅染色液或者考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

    小結   PVDF膜 及Western轉膜液 質量都比較好，染色液的染色結果清晰，便于觀察結果，所以推薦在試驗中使用。

4. 封閉

    這一步一定要保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。加入Western封閉液封閉(脫脂奶粉 或者BSA)。一般采用BSA或者脫脂奶粉，建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個好點的結果比較好。

5. 一抗孵育

    參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗

6. 二抗孵育

    參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。

7. Westernblot 試劑盒顯色及蛋白檢測

    參考相關說明書，使用相應的熒光檢測試劑等ECL類試劑來檢測蛋白。洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒 自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。

8. 膜的重復利用

    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。

9. 分析比較記錄

主要試劑：丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉SDS溶液、濃縮膠緩沖液、TEMED原溶液、SDS-PAGE加樣緩沖液、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、轉移緩沖液、麗春紅染液儲存液、脫脂奶粉、NaN3 0.02% 疊氮鈉、Tween20、一抗、標記二抗、NBT、BCIP、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)、100mmol/L NaCl、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)、5mmol/L EDTA等。