基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此基因克隆又稱DNA克隆、分子克隆、基因重組或重組DNA技術。

      基因克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。為了方便大家學習和交流，我以問答形式介紹基因克隆及其常見問題，希望對大家有所幫助。

    Q1：如何獲取一個已知基因的序列？

A1：對已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡便的一種。獲取基因序列多從文獻中查取，即將別人報道的基因序列直接作為自己DNA克隆的依據。目前，世界上主要的基因庫有：

(1)EMBL，為設在歐洲分子生物學實驗室的基因庫；

(2)Genbank，為設在美國國家衛生研究院(NIH)的基因庫

(3)Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白質序列庫，其所含序列的準確度比較高，而TREMBL只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。

目前，以Genbank的應用最頻繁。

    Q2：什么基因克隆法（Shotgun Cloning）？

A2：該方法是隨機切割供體基因組DNA ，再轉化到受體基因組中，根據對轉化子的表型鑒定，然后找出所需克隆的基因，基因克隆戰略成功地應用于分離細菌的無毒基因。Staskawica B. J .等利用這一策略，從大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的無毒基因。但是在高等植物中，由于基因組很大，因而應用這種方法進行基因克隆非常困難。例如，如果將此方法應用于番茄的抗病基因篩選，需要以雙元載體構建抗病品種的基因文庫，然后通過農桿菌等將它們導入感病品種之中，然后篩選抗病轉化體來分離抗病基因。但這樣鑒定一個單拷貝的基因，需要篩選105株轉基因植株，工作量非常大。

    Q3：什么是TA基因克隆方法（Original TA Cloning Kit）?

A3：利用聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴增產物的3’端自動添加一個3’-A突出端。然后利用一個線性含3’-T突出端的載體舊可以直接高效地連接PCR產物。所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將PCR產物進行優化，不需把PCR產物做平端處理，不需在PCR擴增產物上加接頭，即可直接進行基因克隆。

    Q4：基因克隆時選擇連接酶的原則？

A4：體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是常選的酶，因其能在正常的反應條件下有效的將平端連接起來。

   Q5：基因克隆時選擇內切酶時的注意事項？

A5：在基因克隆設計時盡量使用好切的內切酶，通常是效價高、便宜量大的酶，且注意這兩個酶有比較兼容的Buffer，即在這種公用Buffer中，兩酶的效力變化不大，至少保持60%的活性。

    Q6：如何在基因克隆實驗中檢驗酶切是否*?

A6：根據酶切產物大小評判。例如原來的重組質粒是3000 bp，酶切后，跑出來兩條少于3000 bp的條帶，就說明酶切*了，如果不*的話電泳還會跑出3000 bp的條帶。

    Q7：低產量或無轉化子的原因?

A7：可能有以下幾個原因：

(1)  轉化效率低。這可能是由于大腸桿菌感受態細胞轉化率低或者大腸桿菌無法忍受克隆序列引起，還有可能是電轉化前未除去連接酶和/或PEG，連接酶沒有熱失活，連接酶反應的連接酶過量等原因引起轉化效率低

(2)  DNA質量低。DNA含有污染或者凝膠切割回收時，DNA被UV光損害

(3)  DNA末端不匹配。在選擇限制酶時匹配不正確或者是載體和插入片段未磷酸化，PCR產物切割效率低，克隆時使用的工具酶受到污染等。

(4)  空載體。載體自身環化切割不*造成。

(5)  結構不正確。非特異性PCR產物克隆，或者由于內切或外切核酸酶污染使得插入片段斷裂。

(6)  克隆的插入片段序列錯誤。PCR使用的DNA聚合酶保真性低，凝膠切割回收時DNA被UV光損害，PCR引物錯誤。

(7)  克隆不含質粒。瓊脂培養基中抗生素含量不夠或者衛星克隆。

    Q8：怎樣挑選陽性重組DNA？

A8：1、將轉化后的液體涂布于瓊脂培養基表面，培養基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉化的細菌能在培養基上生長形成單菌落；2、酶切鑒定：挑取的初步陽性克隆菌在培養基中培養，純化質粒，進行雙酶切鑒定。如果酶切出來有兩條帶，其中一條和目的基因長度相似，另一條帶與質粒大小相似，則二次鑒定為陽性克隆；3、最后，將重組質粒送檢測序，如果能得到目的基因序列，則最終確定重組成功。

    Q9：基因克隆中質粒DNA的小量制備？

A9：常見的質粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。常用的為堿裂解法，原理是：在pH 12.0-12.6堿性環境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環質粒（CC）DNA仍為自然狀態。將pH值調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態。通過離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質粒DNA。目前，SunShineBio的商品化質粒小量提取試劑盒可以幫助您回收高質量、高效率的質粒。

    Q10：基因克隆實驗中所需試劑？

A10：1、PCR基因擴增儀；恒溫振蕩培養箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀；電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動成像儀。

2、三角燒瓶，培養皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。

3、微量加樣器；Tip頭；Tip頭盒；Eppendorff管；Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。

4、DNA重組相關試劑：

(1).Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：感受態細胞；氨芐青霉素（100mg/ml）。

(2).LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，10N NaOH調pH至7.0定容至1 L。15磅高壓消毒，4 ℃保存。

(3).LB瓊脂培養基：15 g瓊脂粉溶于1000 ml LB培養基，15磅高壓消毒備用。

5．質粒提取試劑或者質粒提取試劑盒：

溶液Ⅰ(10×)：0.5 M葡萄糖；0.25 M Tris-Cl (pH8.0)；0.1 M EDTA，10磅高壓消毒，4 ℃保存備用。

溶液Ⅱ：0.2M NaOH；1% SDS 室溫貯存，即用即配。

溶液Ⅲ：3M NaOAc (pH4.8) 10磅高壓消毒，室溫貯存。

RNA酶 A：10 mg/ml

TE緩沖液：10 mM Tris-Cl (pH7.6)，1 mM EDTA(pH8.0)

6．質粒DNA的限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關試劑：SunShineBio即用緩沖液；限制性內切酶及酶反應所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10 mg/ml）；6×載樣緩沖液。

50×Tris-乙酸(TAE)貯存液：242 g Tris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）加水至1 L。

Q11：基因克隆實驗中SunShineBio可以提供哪些試劑產品

A11：（1） 核酸試劑盒：SunShineBio質粒小量抽提試劑盒、無內毒素質粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒、電泳Marker。（2）生化試劑及即用試劑：1 M Tris-HCl（pH8.0）、10×TAE Buffer、5×TBE Buffer、EB染料、6×Surcose DNA Loading Buffer、瓊脂、氨芐青霉素、Tris Base等。