摘要：柔嫩艾美耳球蟲作為禽類球蟲病的主要病原體，對家禽養殖業造成嚴重經濟損失。深入開展其基因功能研究對于防控球蟲病意義重大，而高效的電穿孔轉染技術是實現基因操作的關鍵手段。本研究系統探討并優化了柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染條件，通過多因素實驗設計，對電穿孔參數（電壓、脈沖時長、脈沖次數）、轉染緩沖液成分及細胞培養狀態等關鍵因素進行精細調整與分析。結果成功篩選出一套顯著提升轉染效率且保障蟲體活力的優化轉染條件，為后續球蟲基因功能解析、新型疫苗研發等工作筑牢基礎，也為相關寄生蟲轉染技術改進提供了思路與借鑒。
家禽養殖業在全球農業經濟格局中占據舉足輕重的地位，然而，球蟲病的肆虐猶如陰霾籠罩，嚴重制約產業健康發展。柔嫩艾美耳球蟲作為引發雞球蟲病的罪魁禍首之一，憑借其復雜的生活史、強大的致病力，每年致使全球家禽業承受巨額經濟損失，涵蓋生長遲緩、產蛋量銳減、高病死率以及防控成本飆升等多方面負面影響。
在對抗柔嫩艾美耳球蟲的科研征程中，洞悉其基因功能仿若解鎖防控密碼，是開發創新型抗球蟲策略、設計高效疫苗的核心突破口。基因轉染技術，則恰似搭建起從基礎研究通往應用實踐的橋梁，能將外源基因精準導入蟲體，追蹤基因表達、剖析功能機制。當下，電穿孔轉染憑借操作相對簡便、適用范圍廣等優勢，在寄生蟲領域嶄露頭角。不過，相較于哺乳類細胞或部分模式生物，柔嫩艾美耳球蟲因更好的細胞結構、生理特性，現有電穿孔轉染效率參差不齊、蟲體活力受擾等問題突出，猶如荊棘橫亙在深入研究之途。鑒于此，系統、全面優化電穿孔轉染條件，雕琢出契合該蟲體特質的高效方案，成為燃眉之急，不僅為攻克球蟲病難題添磚加瓦，更能輻射啟迪其他寄生蟲基因研究范式。
蟲株與細胞：選用實驗室長期保存、遺傳背景明晰且致病力穩定的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，經嚴格純化、計數處理備用；宿主細胞選取對球蟲易感、生長特性良好的雞胚腎細胞（CEK），依規范流程復蘇、傳代與培養，構建穩定的體外共培養體系。
試劑耗材：高純度的外源質粒 DNA（攜帶熒光報告基因，便于轉染效果直觀監測），電穿孔緩沖液基礎成分（磷酸緩沖鹽溶液、甘露醇、蔗糖等）購自專業生化試劑廠商，各類限制性內切酶、連接酶用于質粒構建與修飾；特制電穿孔杯（不同規格適配多樣樣本量需求）、電穿孔儀（具備精準調控電壓、脈沖參數功能）等耗材設備齊全。
電穿孔參數優化：秉持控制變量原則，設置多組對照實驗。電壓梯度設為 200V - 600V，以 100V 為間隔；脈沖時長在 10ms - 50ms 范圍，按 10ms 遞增；脈沖次數從 1 次至 5 次遞變。各參數組合交叉搭配，構建龐大實驗組矩陣，每組重復 3 - 5 次確保數據可靠性，旨在厘清各參數對轉染效率及蟲體損傷的獨立與交互影響。
轉染緩沖液優化：以基礎緩沖液配方為藍本，精細調控成分比例并引入添加劑。甘露醇濃度在 0.3M - 0.7M 間調整，蔗糖含量從 0.1M - 0.5M 變動，增設不同濃度二甲基亞砜（DMSO，0.5% - 5%）實驗組，探究對細胞膜通透性、蟲體耐受的綜合效應，同樣多重復樣保障統計效力。
細胞培養狀態關聯分析：依據 CEK 細胞培養天數（分 1 - 3 天傳代后不同時段）、細胞密度（低密度、中密度、高密度，借助細胞計數板精準把控）劃分實驗組，剖析宿主細胞處于不同生理階段對球蟲吸附、攝取外源基因及轉染穩定性的潛在助力或阻礙，為營造合理轉染微環境提供依據。
提前制備處于對數生長期、狀態優的 CEK 細胞單層，接種于特制電穿孔小室載玻片，孵育至細胞融合度契合預設分組要求。
輕柔收集適量孢子化卵囊，經胰蛋白酶、膽汁鹽聯合處理，激活脫囊釋放子孢子，洗滌純化后置入含優化電穿孔緩沖液的離心管，混入定量外源質粒 DNA，輕柔混勻確保均勻分散。
將混合樣本小心移入電穿孔杯，精準嵌入電穿孔儀對應卡槽，依既定參數組合啟動電穿孔程序。程序執行完畢，即刻將樣本轉移回含新鮮培養液的培養容器，與 CEK 細胞共孵育，模擬體內寄生環境，靜置于恒溫、恒濕、含適宜二氧化碳濃度的培養箱，定時觀測記錄。
轉染效率監測：借助熒光顯微鏡，于轉染后 24 - 72 小時定期觀察，計數發出綠色熒光（熒光報告基因表達）的蟲體數量占總蟲體數比例，以此直觀量化轉染效率，繪制動態變化曲線，捕捉效率峰值時段與對應轉染條件。
蟲體活力鑒定：綜合運用形態學觀測（顯微鏡下蟲體大小、形態完整性、運動能力）、染色法（臺盼藍拒染評估細胞膜完整性、吉姆薩染色洞察內部細胞器狀態）及子代卵囊產量統計（持續培養多代，對比不同組卵囊生成量衡量生殖力），全面評判轉染操作對蟲體生理機能、繁衍能力的影響，確保優化條件下蟲體維持良好活力。
在電壓維度，當電壓攀升至 400V 時，轉染效率顯著上揚，熒光蟲體占比激增，歸因于適度高電壓高效擊破細胞膜屏障，助力外源基因入胞；但超 500V 后，蟲體因電擊過激，形態扭曲、運動遲滯，活力驟降且轉染效率折損，細胞膜修復失控、內部結構受損嚴重。脈沖時長 30ms 左右時轉染達優，基因導入順暢；過長則熱效應累積、細胞應激加劇，不利轉染與蟲體存活。脈沖次數 3 次為較優節點，多次沖擊在增效同時亦添損傷風險，權衡之下 3 次實現高效與低損平衡。
甘露醇濃度調至 0.5M 時，協同蔗糖 0.3M，滲透壓適配蟲體，維持細胞膨壓同時強化細胞膜韌性，轉染效率較基礎配方近乎翻倍；添入 2% DMSO 恰似 “分子潤滑劑"，微調膜脂流動性，使外源 DNA 更易穿透，且不礙蟲體正常代謝，經子代卵囊穩定產出驗證對生殖力無損，全方面優化轉染表現。
CEK 細胞培養 2 天、達中密度時，釋放足量趨化因子、細胞外基質有序鋪陳，球蟲子孢子吸附緊密、攝取外源基因踴躍，此時電穿孔轉染后，轉染效率較稀疏或過密細胞狀態提升約 30%，且蟲體在 “友好" 宿主微環境滋養下，活力全程穩健，繁衍進程有序推進。
本研究經系統、多維實驗雕琢，整合出柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染 “黃金條件"：400V 電壓、30ms 脈沖時長、3 次脈沖，搭配含 0.5M 甘露醇、0.3M 蔗糖與 2% DMSO 的轉染緩沖液，于 CEK 細胞培養 2 天中密度時段操作。這打破過往轉染低效、蟲體脆弱瓶頸，從原理剖析，精準電參數 “拿捏" 細胞膜穿孔與修復節奏，緩沖液成分 “內外兼修" 護航基因運輸、穩固蟲體生理，適配細胞狀態 “筑巢引鳳"，為基因 - 蟲體互作搭臺。
于應用展望，此優化方案恰似科研 “利器"，在球蟲基因功能深度挖掘中，可加速致病基因、免疫調控基因解析，為靶向藥物設計錨定靶點；于疫苗研創賽道，助力構建基因工程疫苗，導入免疫原性基因激發家禽長效防護；還能作為范例，為瘧原蟲、隱孢子蟲等近緣寄生蟲轉染革新賦能，借技術 “溢出效應"，撬動寄生蟲基因研究邁向新高度，為全球家禽健康、人畜共患病防控注入創新動力。
