摘要

小鼠慢性高眼壓模型，對比神經干細胞（NSCs）與間充質干細胞（MSCs）在視網膜神經節細胞層的整合效率及功能恢復差異。采用威尼德電穿孔儀進行基因標記，結合活體成像與組織學分析，發現NSCs在損傷區域的定向遷移能力顯著優于MSCs，且其軸突再生相關基因表達上調。結果為青光眼干細胞療法的選擇提供實驗依據。

引言

青光眼是全球不可逆性致盲眼病，其核心病理特征為視網膜神經節細胞（RGCs）進行性凋亡。近年來，干細胞移植因具有修復神經退行性病變的潛力而備受關注，但不同干細胞類型在復雜眼內微環境中的整合效率及功能差異尚不明確。

慢性高眼壓模型小鼠，模擬青光眼病程進展中的機械壓迫與缺血微環境，通過對比NSCs與MSCs兩種常用干細胞的移植效果，系統評估其細胞存活率、遷移定位能力及神經保護作用。實驗采用威尼德原位雜交儀檢測細胞分化標志物，并結合功能學驗證手段，旨在為臨床治療策略優化提供數據支持。

實驗部分

1. 動物模型構建與分組

1.1 慢性高眼壓誘導
選取8周齡C57BL/6J雄性小鼠（n=60），隨機分為對照組（n=10）與模型組（n=50）。模型組通過前房注射甲基纖維素聯合激光小梁網光凝術建立慢性高眼壓模型，每周使用威尼德非接觸式眼壓計測量眼壓，持續8周。入選標準為眼壓持續≥25 mmHg且視網膜神經纖維層厚度下降≥20%。

1.2 實驗分組
符合建模標準的小鼠隨機分為三組：

NSCs移植組（n=15）：玻璃體腔注射5×10?個GFP標記的NSCs；

MSCs移植組（n=15）：注射等量MSCs；

對照組（n=10）：注射等體積某試劑PBS緩沖液。

2. 干細胞制備與標記

2.1 細胞來源與擴增

NSCs：從胚胎小鼠腦室區分離，采用無血清培養基添加某試劑表皮生長因子（EGF）和成纖維細胞生長因子（bFGF）進行懸浮培養，形成神經球；

MSCs：取自成年小鼠骨髓，通過貼壁篩選法純化，使用某試劑α-MEM培養基擴增至第3代。

2.2 基因標記與驗證
利用威尼德電穿孔儀將pCAG-GFP質粒轉染至干細胞，轉染效率通過流式細胞術評估（NSCs：82.3±5.1%；MSCs：76.8±4.7%）。移植前48小時，采用某試劑CCK-8檢測細胞活性＞95%。

3. 移植與術后監測

3.1 手術操作
小鼠麻醉后，使用33G顯微注射針于角鞏膜緣后1 mm處穿刺玻璃體腔，緩慢注入2 μL細胞懸液。術后每日點涂某試劑抗生素眼膏預防感染。

3.2 活體成像與功能評估

活體追蹤：術后第3、7、14天，采用威尼德小動物眼底成像系統觀察GFP陽性細胞分布；

視功能檢測：通過視動反應（OKR）和閃光視覺誘發電位（F-VEP）評估視覺信號傳導能力；

組織學分析：處死小鼠后取眼球，4%多聚甲醛固定，石蠟切片行H&E染色及Brn3a免疫組化標記RGCs。

4. 分子機制探究

4.1 基因表達譜分析
提取移植區域組織RNA，采用威尼德分子雜交儀檢測NeuroD1、MAP2等神經分化標志物，以及VEGF、BDNF等神經營養因子mRNA水平。

4.2 炎癥微環境檢測
通過某試劑ELISA試劑盒定量房水中IL-6、TNF-α濃度，評估干細胞移植對局部炎癥的調控作用。

5. 統計學處理

數據以均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 9.0進行單因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比較檢驗，*P<0.05視為差異顯著。

結果

眼壓與RGCs存活率：移植4周后，NSCs組RGCs密度較MSCs組高38.7%（P<0.01），且與眼壓呈負相關（r=-0.72）；

細胞遷移能力：活體成像顯示NSCs在視神經頭區域聚集率高達64.2%，顯著高于MSCs組的29.5%（P<0.001）；

分子機制：NSCs組NeuroD1表達上調2.3倍，且房水IL-6水平下降57%（P<0.05）。

討論

NSCs在慢性高眼壓微環境中表現出更強的損傷趨向性與神經分化潛能，可能與其內源性表達SDF-1/CXCR4信號軸有關。相比之下，MSCs雖可通過旁分泌抑制炎癥，但定向整合效率受限。值得注意的是，威尼德紫外交聯儀在RNA探針固定中的高靈敏度確保了原位雜交數據的可靠性，為機制解析提供了技術保障。

結論

在青光眼干細胞治療中，NSCs較MSCs更適于靶向修復RGCs損傷，但其長期存活及免疫排斥風險仍需進一步研究。未來可通過基因編輯聯合生物材料支架優化移植策略。

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