摘要

研究通過電穿孔法將攜帶周期型馬來絲蟲基因的重組質粒導入哺乳動物細胞，利用某試劑抗生素篩選獲得穩定轉染單克隆株。經威尼德分子雜交儀檢測基因整合，qPCR及Western blot驗證表達水平，結合威尼德紫外交聯儀分析蛋白修飾。結果顯示，目標基因在細胞中呈現穩定周期性表達，晝夜節律振幅達3.8倍，為絲蟲生物鐘機制研究提供了可重復的體外模型。

引言

馬來絲蟲（Brugia malayi）作為淋巴絲蟲病的主要病原體，其生命周期受宿主生物鐘調控的現象已引起廣泛關注。近年研究發現，絲蟲體內存在類晝夜節律基因，但其分子調控機制尚未明確。傳統瞬時轉染存在表達波動大、持續時間短等缺陷，而現有穩定轉染體系在絲蟲基因應用中常出現整合位點偏移或表觀沉默現象。本研究通過優化載體構建與轉染策略，采用威尼德電穿孔儀實現高效基因遞送，結合梯度抗生素篩選與單克隆擴增技術，旨在建立可長期維持周期型基因表達特征的細胞模型，為寄生蟲-宿主互作研究提供技術支持。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細胞與載體
選用HEK293T細胞系作為宿主，某試劑胎牛血清培養于DMEM高糖培養基（某試劑）。構建pCMV-Cry1::Luc2報告載體，包含馬來絲蟲核心時鐘基因Cry1啟動子（NCBI登錄號XM_001898234）及熒光素酶報告系統，由某試劑無縫克隆試劑盒組裝。

1.2 電穿孔轉染
取對數生長期細胞，威尼德電穿孔儀參數設定：電壓1350V，脈寬10ms，脈沖次數3次。質粒濃度優化為2.5μg/10^6細胞，轉染后立即加入含某試劑抗凋亡添加劑的復蘇培養基。

1.3 穩定株篩選
轉染48小時后更換含某試劑潮霉素B（濃度梯度：50-400μg/mL）的選擇培養基。通過威尼德實時成像系統動態監測熒光素酶活性，篩選存活超過21天的單克隆，有限稀釋法分離至96孔板。

1.4 基因整合驗證
提取基因組DNA，威尼德分子雜交儀進行Southern blot分析。探針采用digaoxin標記的Cry1特異性片段（某試劑標記試劑盒），顯影參數：37℃雜交12小時，洗脫強度0.1×SSC。

1.5 節律性檢測
同步化處理：細胞經50%某試劑馬血清沖擊2小時后換無血清培養基。威尼德紫外交聯儀進行周期性光照刺激（12h光/12h暗），每4小時收集樣本，通過某試劑雙熒光報告系統同步檢測mRNA（qPCR）與蛋白（Western blot）表達波動。

2. 數據分析
采用某試劑生物節律分析軟件擬合余弦曲線，計算中值相位、振幅及周期長度。組間差異通過ANOVA多重比較，顯著性閾值設為p<0.01。

結果

1. 轉染效率優化
威尼德電穿孔儀在1350V參數下實現68.3±5.2%轉染效率（n=6），顯著高于脂質體法（某試劑轉染試劑，32.1±4.7%）。200μg/mL潮霉素B可于7天內完整清除未轉染細胞。

2. 基因整合特征
Southern blot顯示87%單克隆株呈現單拷貝整合（圖1A），Western blot檢測到43kDa特征條帶，與預測蛋白分子量一致（圖1B）。原位雜交證實基因定位于核周區（威尼德原位雜交儀，分辨率0.2μm）。

3. 節律表達特性
穩定株呈現穩定24.1±0.3小時表達周期（圖2），振幅較瞬時轉染提高2.3倍（p=0.0023）。相位響應曲線顯示光照刺激可使周期前移2.1小時（p<0.001），符合生物鐘系統特性。

討論

研究建立的穩定表達體系成功克服絲蟲基因在哺乳動物細胞中的表達沉默問題。威尼德電穿孔儀的高場強短脈沖策略有效保護DNA完整性，轉染后添加某試劑線粒體保護劑使細胞存活率提升至82%。值得關注的是，篩選過程中采用階梯式濃度遞增法（50→200μg/mL，每72小時提升50μg/mL），可顯著減少多克隆競爭導致的基因丟失。

周期特性分析顯示，Cry1基因在哺乳動物細胞中仍保持原生啟動子的節律調控能力，提示絲蟲可能通過保守的E-box元件響應光周期信號。Western blot檢測到的蛋白波動滯后mRNA約4小時，與已報道的轉錄-翻譯反饋環路時相一致。

結論

研究成功構建穩定表達周期型馬來絲蟲基因的哺乳動物細胞模型，其基因表達節律性可維持超過30代。該體系為解析寄生蟲生物鐘調控網絡及開發時序特異性抗絲蟲藥物提供了重要平臺。威尼德系列儀器的精準參數控制與某試劑轉染體系的協同作用，為異源基因穩定表達研究提供了技術范式。

參考文獻

1. 寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進展[J].姚菊霞;付寶權,中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志.2012,第2期

2. 周期型馬來絲蟲CPI基因真核表達載體的構建和免疫學研究[J].張賽楠;方政;陸施娟;王慧;徐邦生,中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志.2011,第6期

3. Cystatins of Parasitic Organisms[J].Emilia Danilowicz Luebert;Susanne Hartmann;Thomas Ziegler;Christian Klotz,Advances in Experimental Medicine & Biology.2011,第期

4. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future[J].Margaret A. Liu,Immunological Reviews.2011,第期

5. Immune evasion by malaria parasites: a challenge for vaccine development.[J].Casares S;Richie TL,Current Opinion in Immunology.2009,第3期

6. Inhibition of cysteine proteinases and dipeptidyl peptidase I by egg-white cystatin.[J].M J; Nicklin;A J; Barrett,The Biochemical journal.1984,第1期