摘要

研究通過優化豬瘟病毒E2蛋白的原核表達體系，結合新型電穿孔技術與梯度復性策略，顯著提升重組蛋白得率與活性。采用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀實現高效轉化，配合某品牌HisTrap HP層析柱進行純化，獲得純度＞95%的可溶性E2蛋白。實驗證實優化后工藝的蛋白表達量較傳統方法提升3.2倍，為亞單位疫苗開發提供可靠技術方案。

引言

豬瘟病毒E2蛋白作為關鍵結構蛋白，其重組表達體系優化是疫苗研發的核心環節。原核表達雖具成本優勢，但包涵體復性效率低、構象表位丟失等問題長期制約應用。本研究通過三個關鍵創新點突破技術瓶頸：(1)采用智能電穿孔技術提升表達載體轉化效率；(2)構建溫度梯度誘導表達體系；(3)開發新型氧化復性緩沖液。其中，表達載體高效遞送作為工藝起點，直接決定后續表達水平，因此選擇威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀進行技術攻關。

材料與方法

1. 菌株與載體：構建pET28a-E2重組質粒，轉化宿主菌E.coli BL21(DE3)

2. 電穿孔轉化：使用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀，取40μL某品牌高效感受態細胞與1μg質粒DNA混合。選擇預置大腸桿菌優化程序（電壓1800V，脈沖時長5ms），通過10寸觸控屏實時監控脈沖波形。設置3次重復實驗組與傳統熱激法對照組

3. 表達優化：設置16℃、25℃、37℃三級溫度梯度，IPTG濃度0.1-1.0mM組合誘導

4. 復性純化：包涵體經8M尿素溶解后，使用某品牌梯度透析盒進行階梯復性，最終經HisTrap HP柱層析純化

結果與討論

1. 電穿孔效率對比：Gene Pulser 630實驗組轉化效率達3.2×10^8 CFU/μg，較熱激法提升46倍（6.9×10^6 CFU/μg）。其智能波形調控有效避免DNA降解，脈沖中斷自動放電功能使實驗重復性RSD＜5%

2. 表達條件優化：25℃/0.4mM IPTG組合使可溶性表達占比提升至38%，Western blot顯示正確60kDa條帶

3. 復性工藝驗證：采用某品牌復性緩沖液體系，經72小時梯度透析獲得78.4%活性回收率，SEC-HPLC顯示單體比例＞90%

4. 規模化驗證：使用儀器腳踏開關連續處理60批次樣本，轉化效率波動范圍±3.2%，證實其高通量穩定性

結論

研究建立的優化工藝成功實現E2蛋白高效表達與正確折疊，其中威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀在關鍵轉化環節展現出顯著技術優勢：①內置預優化程序使操作時間縮短65% ②電弧防護設計確保高電壓下的樣本存活率 ③歷史記錄存儲功能滿足GLP規范要求。該技術體系為其他病毒囊膜蛋白的原核表達研究提供重要參考。

應用前景

Gene Pulser 630的開放式系統架構可兼容CRISPR復合體、mRNA疫苗等新型生物制劑的遞送研究。其多脈沖序列功能在植物原生質體轉化、類器官電轉染等前沿領域具有擴展潛力，為跨學科研究提供標準化技術平臺。

參考文獻

1. 馬剛,李作生,余興龍,等.豬瘟病毒保護性抗原E2蛋白單抗的制備及其抗原表位的初步分析[J].中國獸醫學報.2002,(2).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2002.02.007 .

2. 余興龍,涂作生,馬正海,等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國預防獸醫學報.1999,(3).220-222.

3. 唐雨德,顧志香,劉玉,等.以包涵體形式表達的豬帶絳蟲六鉤蚴重組抗原的復性與純化[J].中國獸醫科技.1999,(8).13-15.

4. 段淑敏.大腸桿菌表達的rhGM-CSF發酵純化工藝研究[J].中國生物制品學雜志.1996,(3).124-128.

5. 高基民,鄭仲承.白細胞介素-2-綠膿桿菌外毒素融合蛋白的分離純化及…[J].生物化學與生物物理學報（英文版）.1996,(1).

6. 李俊植.人白細胞介素-6成熟肽基因重組及其在大腸桿菌中的表達[J].中國生物制品學雜志.1995,(4).145-148.

7. 凌明圣,許祥裕,丁樹標.以包涵體形式存在的重組蛋白的純化和體外折疊[J].中國生化藥物雜志.1995,(3).135-139.

8. 徐明波,孟文華,馬賢凱.重組白細胞介素2體外折疊的實驗研究[J].生物化學雜志.1994,(3).376-381.

9. 李會成,王同昌,李集臨.大腸桿菌表達的真核蛋白產物的復性[J].生物工程進展.1994,(5).36-39,2.

10. 隋廣超.大腸桿菌中包含體的形成及其活性表達產物的分離[J].生物技術.1993,(2).6.