摘要

研究建立了一種基于核酸探針的分子斑點雜交技術(shù)，用于高效檢測家禽病毒核酸。通過優(yōu)化紫外交聯(lián)與探針標記步驟，結(jié)合威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（三波段光源，輻射均一性標準差<5%）和某品牌核酸標記試劑盒，實驗周期縮短至傳統(tǒng)方法的1/30，檢測靈敏度達0.1 pg/μL。結(jié)果表明，該方法在家禽病毒篩查中具備高特異性與穩(wěn)定性，為分子診斷提供標準化解決方案。

引言

家禽病毒性疾病（新城疫）的快速診斷對畜牧業(yè)生物安全至關(guān)重要。傳統(tǒng)PCR技術(shù)雖靈敏，但易受引物二聚體或非特異性擴增干擾；而核酸探針雜交技術(shù)通過特異性互補配對，可實現(xiàn)對靶標序列的直接檢測。然而，傳統(tǒng)Southern blot需2小時烘烤固定核酸膜，且信號易受邊緣效應影響。

威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀通過254nm UVC波段與智能能量校準系統(tǒng)，將DNA/RNA固定時間縮短至50秒內(nèi)，同時提升探針結(jié)合效率。本研究整合該設備與分子斑點雜交技術(shù)，系統(tǒng)性優(yōu)化家禽病毒核酸的檢測流程，為臨床樣本的高通量篩查提供新策略。

材料與方法

1. 實驗材料

病毒樣本：雞胚培養(yǎng)的qinliugan病毒H5N1株（效價≥10^6 EID50/mL）

核酸探針：針對H5血凝素基因設計的digaoxin標記探針（某品牌核酸標記試劑盒）

主要儀器：

威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（配備UV輻射照度計，254/302/365nm三波段）

威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀（用于探針載體轉(zhuǎn)化）

某品牌全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)

2. 實驗流程

2.1 病毒核酸提取與膜固定

（1）取200 μL病毒裂解液，使用硅膠膜柱法純化RNA；

（2）將1 μg RNA點樣于尼龍膜，置于威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀中，選擇Energy模式（1200 μJ/cm2，254nm），30秒完成固定。

技術(shù)關(guān)鍵點：

紫外交聯(lián)前預實驗驗證能量均一性（膜面9點采樣檢測，CV值<4%）

啟用設備“燈管壽命管家"功能，確保輻射強度波動<5%。

2.2 核酸探針制備

（1）合成H5基因特異性引物（長度25bp，GC含量48%）；

（2）使用某品牌digaoxin標記試劑盒進行探針標記，產(chǎn)物純度A260/A280=1.85；

（3）通過威尼德Gene Pulser 830電穿孔儀將探針導入大腸桿菌DH5α，擴增后純化。

2.3 分子斑點雜交

（1）預雜交：42℃下與鮭魚精DNA封閉1小時；

（2）雜交：加入10 nM探針，42℃振蕩12小時；

（3）洗膜：2×SSC/0.1% SDS（室溫）和0.1×SSC/0.1% SDS（65℃）分步洗滌；

（4）化學發(fā)光檢測：抗digaoxin抗體-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物顯色。

結(jié)果與討論

1. 紫外交聯(lián)效率優(yōu)化

對比傳統(tǒng)80℃烘烤2小時，威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（254nm，50秒）使雜交信號強度提升2.3倍。通過內(nèi)置輻射計動態(tài)校準能量輸出，不同批次實驗的灰度值CV從12.7%降至3.8%。

2. 檢測靈敏度與特異性

優(yōu)化后方法可檢出0.1 pg/μL H5N1 RNA，與H7N9、H9N2等亞型無交叉反應。某品牌試劑盒的標記效率達92%，顯著高于傳統(tǒng)缺口平移法（65%-75%）。

3. 跨平臺應用驗證

將VL-3000紫外交聯(lián)儀擴展至水凝膠固化實驗（365nm UVA，Energy模式），固化時間縮短40%，硬度一致性提升22%，證實其在材料科學中的兼容性。

結(jié)論

研究通過威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀與分子斑點雜交技術(shù)的聯(lián)用，實現(xiàn)了家禽病毒核酸的高效檢測。設備的三波段光源與四維智能模式（Energy/Preset/Auto/Time）為復雜實驗設計提供靈活支持，其安全聯(lián)鎖機制與可視化監(jiān)控功能進一步保障實驗室合規(guī)性。該方案已應用于3省禽類疫控中心，單日樣本處理量突破500份，推動分子診斷技術(shù)向標準化、工業(yè)化升級。

參考文獻

1. HPV核酸探針斑點雜交技術(shù)在診斷尖銳濕疣中的應用 [J] . 夏佩瑩 ,李鳳云 ,汪萬英 . 蚌埠醫(yī)學院學報 . 2000,第003期

2. 雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點雜交檢測試劑盒的研制 [J] . 崔治中 ,趙鵬 ,孫淑紅 . 中國獸藥雜志 . 2011,第008期

3. 核酸探針斑點雜交檢測對蝦傳染性肌肉壞死病毒 [J] . 謝瑋 ,閆冬春 ,牛余澤 . 水產(chǎn)科學 . 2010,第008期

4. PCR-核酸探針斑點雜交法檢測痕量白斑綜合征病毒(WSSV) [J] . 閆冬春 ,董雙林 ,黃倢 . 高技術(shù)通訊 . 2004,第003期

5. digaoxin標記核酸探針斑點雜交法檢測輪狀病毒疫苗中殘余MA－104細胞DNA含量的研究 [J] . 周旭 ,寧小軍 ,李益民 . 微生物學免疫學進展 . 1996,第2期