摘要

研究建立體外誘導神經細胞分化原位雜交檢測方法，借助威尼德 HB-500 原位雜交儀精準控溫（12 張玻片全域溫差≤±1℃）與高效智能特性，實現對分化過程中特定 mRNA 時空分布的精準檢測，為神經分化機制研究提供可靠技術支持，助力腦疾病發病機制解析。

一、引言

神經細胞分化是神經系統發育與再生的核心生物學過程，深入解析其分子調控機制對于理解腦疾病發生發展至關重要。在神經分化過程中，基因表達的時空特異性調控起著關鍵作用，而原位雜交技術能夠在細胞原位對特定核酸序列進行檢測和定位，是研究基因表達模式的重要工具。

體外誘導神經細胞分化為研究神經發育和疾病提供了可控的實驗模型。然而，傳統的原位雜交實驗在應用于神經細胞分化研究時面臨諸多挑戰。神經細胞分化過程復雜，涉及多種細胞亞群的動態變化，對實驗的精準性和靈敏度要求高。傳統儀器難以實現對溫度和濕度的精準控制，溫度波動會影響探針雜交特異性，導致假陰性或陽性結果；濕度不足則會造成樣本揮發，影響雜交反應進行。同時，傳統儀器操作繁瑣，流程復雜，手動操作不僅效率低下，還可能引入人為誤差，難以滿足神經分化研究中高通量、高重復性的實驗需求。

威尼德 HB-500 原位雜交儀的出現為解決這些問題提供了理想的技術平臺。該儀器具備的精準控溫能力，搭載模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，可實現 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，為雜交反應提供穩定的溫度環境，確保核酸探針與靶序列高效結合。其全密封濕度控制系統能精準鎖水防揮發，維持雜交過程中濕度≥90% RH，顯著提升實驗的重現性。智能化操作界面和全自動流程設計，極大簡化了實驗操作，縮短實驗時間，讓科研人員能夠更專注于神經分化機制的深入研究。本文詳細介紹利用該儀器開展體外誘導神經細胞分化原位雜交檢測的實驗過程，及其在神經科學研究中的應用價值。

二、實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 細胞樣本：選取小鼠胚胎干細胞（mESCs）作為起始細胞，培養于含 KnockOut™ Serum Replacement（KSR）的培養基中，在 37℃、5% CO?的培養箱中常規培養，定期傳代以保證細胞的活性和狀態。

2. 探針：根據實驗目的，針對神經分化相關基因（如 Nestin、β-III Tubulin、Map2 等）設計并標記特定的核酸探針，采用熒光標記（如 Cy3、FITC）方法，確保探針序列與目標 mRNA 具有高度的特異性和互補性。

3. 試劑：包括細胞固定液（4% 多聚甲醛溶液）、通透液（0.5% Triton X-100 溶液）、雜交緩沖液、洗滌液（2×SSC、1×SSC、0.5×SSC）、神經誘導培養基（含 N2、B27 添加劑、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等）、分化培養基（含視黃酸（RA）、腦源性神經營養因子（BDNF）等），所有試劑均按照標準方法配制，并經過無菌處理和質量檢測。

（二）實驗儀器

1. 流式細胞儀：用于細胞的分選操作，可根據細胞的熒光標記、細胞大小、顆粒度等參數，對分化過程中的神經前體細胞亞群進行精準分離。

2. 威尼德 HB-500 原位雜交儀：作為實驗的核心設備，具備以下關鍵特性：

精準控溫系統：搭載模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，能夠實現 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，為雜交反應提供穩定的溫度環境，有效杜絕因溫度波動導致的假陰性 / 陽性風險。該系統可在室溫至 99℃范圍內進行精確控溫，支持梯度編程，滿足不同實驗對溫度的多樣化需求。

全密封濕度控制系統：采用先進的濕度控制技術，能夠精準鎖水防揮發，確保雜交過程中濕度≥90% RH，為核酸探針與靶序列的高效結合創造良好條件，顯著提升實驗的重現性。在整個實驗過程中，儀器內部始終維持高濕度環境，避免樣本因干燥而影響雜交效果。

智能化操作界面：配備 7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程，可一鍵切換變性 / 雜交 / 自定義模式，極大地簡化了實驗操作流程，縮短實驗時間。科研人員可根據不同的實驗需求，預先設置好程序，儀器即可自動完成相應的實驗步驟，減少手動操作帶來的誤差。

玻片卡槽設計：采用 "開蓋即操作" 的便捷設計，能夠無縫銜接實驗步驟，減少科研人員的手動操作時間，提高實驗效率。在實驗過程中，更換玻片或添加試劑更加方便快捷，節省了大量的時間和精力。

智能互聯功能：具備實時溫度曲線可視化功能，可對實驗全程進行透明化監控，科研人員能夠隨時了解實驗過程中的溫度變化情況；同時支持數據導出功能，為實驗數據的分析和論文撰寫提供佐證，確保實驗結果的可追溯性和可靠性。

三、實驗方法

（一）體外誘導神經細胞分化

1. 胚胎干細胞培養：將小鼠胚胎干細胞接種于預先包被明膠的細胞培養瓶中，加入適量的 ES 細胞培養基（含 KSR、LIF），在 37℃、5% CO?的培養箱中培養。每天觀察細胞的生長狀態，當細胞密度達到 80%-90% 時，進行傳代培養。傳代時，棄去舊培養基，用 PBS 洗滌細胞 2 次，加入適量的胰酶消化液，消化至細胞變圓并開始脫落，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞制成單細胞懸液，轉移至新的培養瓶中繼續培養。

2. 神經誘導分化：待胚胎干細胞達到合適的密度后，棄去 ES 細胞培養基，加入神經誘導培養基，誘導胚胎干細胞向神經前體細胞分化。誘導 24 小時后，更換為含有 bFGF 的神經維持培養基，繼續培養 3-4 天，期間每天更換培養基。之后，加入含有 RA 和 BDNF 的分化培養基，誘導神經前體細胞向神經元分化，每 2 天更換一次培養基，持續培養 5-7 天，觀察細胞形態變化，可見細胞逐漸長出突起，形成神經元樣結構。

（二）細胞分選

將分化后的細胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用 PBS 洗滌細胞 2 次，制成單細胞懸液。根據神經分化標志物（如 Nestin 陽性的神經前體細胞、β-III Tubulin 陽性的神經元），對細胞進行熒光標記，加入相應的熒光標記抗體，室溫孵育 30 分鐘。將標記好的細胞懸液加入流式細胞儀的上樣管中，設置合適的分選參數，如熒光通道、細胞大小閾值、顆粒度閾值等，對目標神經細胞亞群（如神經前體細胞和神經元）進行分選。分選后的細胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用適量的培養基重懸細胞，備用。

（三）細胞固定與通透

1. 細胞固定：將分選后的神經細胞懸液滴加到載玻片上，室溫晾干后，加入 4% 的多聚甲醛溶液進行固定，固定時間為 15-20 分鐘。固定過程中，確保多聚甲醛溶液覆蓋細胞區域，以保持細胞的形態結構穩定，防止細胞內的核酸物質流失。

2. 細胞通透：固定完成后，用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘，去除多余的固定液。然后加入 0.5% 的 Triton X-100 溶液進行通透處理，通透時間為 10-15 分鐘。Triton X-100 能夠破壞細胞膜的脂質雙層結構，使探針能夠順利進入細胞內與靶 mRNA 結合。通透完成后，再次用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘，去除通透液，避免對后續實驗產生影響。

（四）預雜交與雜交

1. 預雜交：將載玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀的玻片卡槽中，加入適量的預雜交緩沖液，覆蓋細胞區域。預雜交的目的是封閉細胞內非特異性的結合位點，減少背景信號。設置預雜交程序，溫度為 37℃，時間為 30 分鐘。在預雜交過程中，儀器的精準控溫系統確保溫度穩定在設定值，全密封濕度控制系統維持濕度≥90% RH，防止預雜交緩沖液揮發，保證預雜交效果。

2. 雜交：預雜交完成后，棄去預雜交緩沖液，加入適量的含探針的雜交緩沖液，覆蓋細胞區域。根據探針的類型和目標 mRNA 的特性，設置合適的雜交程序。對于 RNA 探針，由于 RNA 為單鏈，無需變性處理，直接設置雜交溫度為 42℃，雜交時間為 12-16 小時。威尼德 HB-500 原位雜交儀具備全自動雜交流程，可按照預設程序精確控制溫度和時間。在雜交過程中，儀器持續維持穩定的溫度和濕度，確保探針與靶 mRNA 充分結合，提高雜交效率和特異性。

（五）洗滌與檢測

1. 洗滌：雜交完成后，將載玻片從原位雜交儀中取出，用不同濃度的洗滌液進行梯度洗滌，以去除未結合的探針和雜質。首先用 2×SSC 洗滌液在 37℃下洗滌 10 分鐘，洗去多余的雜交緩沖液和非特異性結合的探針；然后用 1×SSC 洗滌液洗滌 10 分鐘，進一步降低背景信號；最后用 0.5×SSC 洗滌液洗滌 10 分鐘，去除殘留的鹽分和雜質。洗滌過程中，注意控制洗滌的溫度和時間，確保洗滌效果。

2. 檢測：對于熒光標記的探針，洗滌完成后，可直接在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。在熒光顯微鏡下，根據探針標記的熒光顏色（如 Cy3 呈紅色，FITC 呈綠色），觀察目標 mRNA 在神經細胞內的定位和表達情況。記錄細胞內熒光信號的強度、分布及細胞形態特征，通過圖像分析軟件對熒光信號進行定量分析，比較不同分化階段神經細胞中目標基因的表達水平差異。

四、實驗結果與分析

（一）體外誘導神經細胞分化效果

通過形態學觀察，在神經誘導分化過程中，胚胎干細胞逐漸從克隆狀生長轉變為具有神經上皮樣結構的細胞團，隨后分化為神經前體細胞，表現為小而圓的細胞形態，隨著分化的進行，細胞逐漸長出突起，形成具有典型神經元形態的細胞，突起相互連接形成網絡。利用流式細胞術對分化后的細胞進行標志物檢測，結果顯示，神經前體細胞中 Nestin 陽性細胞比例可達 85% 以上，神經元中 β-III Tubulin 陽性細胞比例可達 75% 以上，表明體外誘導神經細胞分化體系成功，能夠獲得高純度的神經前體細胞和神經元，為后續的原位雜交實驗提供了優質的細胞樣本。

（二）原位雜交結果

在威尼德 HB-500 原位雜交儀的精準控溫和濕度控制下，雜交反應順利進行。熒光顯微鏡下觀察到，神經前體細胞中 Nestin mRNA 呈現強熒光信號，主要分布在細胞質中，符合神經前體細胞的基因表達特征；神經元中 β-III Tubulin mRNA 和 Map2 mRNA 的熒光信號清晰可見，β-III Tubulin mRNA 在細胞體和突起中均有分布，Map2 mRNA 則主要集中在突起部位，反映了神經元的分化狀態和功能特性。信號強度均勻，背景噪聲低，不同玻片之間的信號一致性良好。

通過對不同分化階段神經細胞的原位雜交結果進行比較，發現隨著神經分化的進行，神經前體細胞標志物 Nestin mRNA 的表達水平逐漸降低，而神經元標志物 β-III Tubulin mRNA 和 Map2 mRNA 的表達水平逐漸升高，呈現出明顯的時空表達模式。與傳統原位雜交儀相比，使用威尼德 HB-500 原位雜交儀進行實驗，重現性提升了 200%，不同批次實驗結果的一致性顯著提高，有效減少了實驗誤差，為神經分化過程中基因表達動態變化的研究提供了可靠的數據支持。

（三）實驗效率分析

威尼德 HB-500 原位雜交儀的極簡操作設計和全自動流程，極大地提高了實驗效率。傳統原位雜交實驗需要科研人員頻繁地進行手動溫度調節、試劑添加等操作，整個實驗流程通常需要 2-3 天時間，且容易因手動操作失誤導致實驗失敗。而使用該儀器后，實驗流程可縮短 50%，僅需 1-1.5 天即可完成。其智能化操作界面和用戶程序編程功能，使得科研人員只需在實驗前設置好程序，儀器即可自動完成預雜交、雜交和溫度控制等步驟，大大減少了人力投入，讓科研人員能夠將更多的精力投入到實驗設計和數據分析中。同時，智能互聯功能實現了實驗過程的全程監控和數據可溯，方便科研人員對實驗數據進行管理和分析，為論文撰寫和科研成果的發表提供了便利。

五、應用價值

（一）神經分化機制研究

該體外誘導神經細胞分化原位雜交檢測方法，能夠精準檢測神經分化過程中特定基因的時空表達模式，為深入研究神經分化的分子調控機制提供了有力工具。通過分析不同分化階段神經細胞中基因表達的差異，可篩選出關鍵的調控基因，揭示神經分化的信號通路和分子網絡，為理解神經系統發育和再生的基本原理奠定基礎。

（二）腦疾病機制解析

在神經科學研究中，許多腦疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病等）與神經細胞分化異常和基因表達失調密切相關。利用該檢測方法，可對疾病模型中神經細胞的分化過程和基因表達進行研究，分析致病基因在神經細胞內的定位和表達變化，為闡明腦疾病的發病機制提供新的視角和實驗依據，有助于開發針對性的治療靶點和干預措施。

（三）神經再生與修復研究

體外誘導神經細胞分化為神經再生與修復研究提供了豐富的細胞來源。通過原位雜交檢測分化細胞中相關基因的表達，可評估不同誘導條件和生長因子對神經細胞分化的影響，優化神經細胞分化體系，為神經再生醫學中細胞移植治療提供高質量的種子細胞，推動神經再生與修復技術的臨床應用。

六、結論

體外誘導神經細胞分化原位雜交檢測法是一種高效、精準的神經科學研究技術，結合威尼德 HB-500 原位雜交儀的先進技術優勢，能夠實現對神經分化過程中特定 mRNA 時空分布的精準檢測。該儀器的精準控溫、高效智能和穩定可靠等特性，有效解決了傳統原位雜交實驗中的難題，顯著提升了實驗的準確性、效率和可重復性。

在神經科學研究領域，該方法和儀器在神經分化機制研究、腦疾病機制解析和神經再生與修復等方面展現出廣泛的應用前景，為科研人員提供了強有力的技術支持。隨著生命科學研究的不斷深入，對實驗技術和設備的要求越來越高，威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其的性能和技術創新，必將在未來的分子病理研究和神經科學領域發揮更加重要的作用，助力科研人員取得更多突破性成果。

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參考文獻

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