摘要

地中海擬無枝酸菌 S699 作為重要工業菌株，其高效電轉化體系構建對次級代謝產物合成路徑解析至關重要。研究基于 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，通過優化感受態細胞制備工藝與電轉參數，建立穩定轉化體系。結果顯示，該儀器雙波協同技術使轉化效率提升 30% 以上，環境菌株基因操作提供標準化方案。

引言

在微生物工程與合成生物學領域，地中海擬無枝酸菌 S699 因具有次級代謝產物合成能力，成為藥物開發的重要底盤菌株。然而，其厚重的細胞壁結構與復雜膜成分，導致傳統電轉化技術面臨參數優化周期長、細胞死亡率高、轉化效率不穩定等瓶頸，嚴重制約了基因編輯與代謝工程改造的研究進程。

Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀作為新一代分子遞送平臺，創新性集成雙波協同技術與智能防護系統，為解決難轉染菌株的電轉化難題提供了突破性方案。該儀器可根據細胞類型智能切換方波與指數波，精準調控跨膜電勢形成與膜修復過程，在保證高轉化效率的同時顯著降低細胞損傷。內置的 200 + 種細胞株預優化數據庫，支持地中海擬無枝酸菌等特殊菌株的參數快速預判，配合電弧防護 3.0 系統，能有效避免電火花對珍貴樣本的不可逆損傷。本文圍繞 S699 菌株的感受態細胞制備工藝與電轉化關鍵參數展開系統性研究，結合 Gene Pulser X2 的技術優勢建立高效轉化體系，為相關領域的基因操作提供可復制的技術模板。

材料與方法

實驗材料

1. 菌株與質粒：地中海擬無枝酸菌 S699 菌株（實驗室保藏，經 16S rRNA 基因測序驗證），攜帶阿霉素抗性基因的重組質粒 pS699-AMD（實驗室自主構建，通過核酸蛋白分析儀測定純度，OD???/OD???為 1.85，濃度為 250 ng/μL）。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉緩沖液，成分為 270 mM 山梨醇、2 mM CaCl?、10 mM Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5），改良 ISP2 培養基（含酵母提取物 4 g/L、麥芽提取物 10 g/L、葡萄糖 4 g/L，固體培養基添加 18 g/L 瓊脂），阿霉素（工作濃度 10 μg/mL，經 0.22 μm 濾膜除菌，用于陽性克隆篩選）。

3. 儀器： Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀（配備 0.1 cm 間隙電轉杯，經校準驗證脈沖參數精度誤差＜1%），高速冷凍離心機（溫控精度 ±0.3℃，轉速控制精度 ±20 r/min），厭氧培養箱（氧濃度控制精度 ±0.1%），全波長酶標儀（OD???檢測精度 ±0.005）。

感受態細胞制備

1. 活化復蘇：從 - 80℃冰箱取 S699 甘油管，劃線接種于改良 ISP2 固體培養基，28℃培養 5-7 天至單菌落形成。挑取形態均一的單菌落，接種于 5 mL 液體培養基，28℃、200 r/min 振蕩培養 48 小時至對數生長期中期。

2. 擴大培養：按 1:100 接種量轉接至 100 mL 新鮮培養基，相同條件培養至 OD???為 0.6-0.8（每 30 分鐘取樣檢測，避免過度培養）。

3. 低溫預處理：菌液冰浴 45 分鐘后，轉入預冷離心管，4℃、5000 r/min 離心 15 分鐘。棄上清后，用 10 mL 預冷電轉緩沖液輕柔重懸菌體，重復離心洗滌 3 次，每次洗滌后需在冰上靜置 10 分鐘以確保細胞充分分散。

4. 濃度標準化：最終用預冷緩沖液將細胞密度調整至 1×101? CFU/mL，按 50 μL / 管分裝于預冷 EP 管，液氮速凍后置于 - 80℃保存（實驗前需在冰上緩慢解凍，避免溫度驟變影響細胞活性）。

電轉化條件優化實驗

1. 樣品預處理：取 50 μL 感受態細胞，加入 1 μL 重組質粒（250 ng），用滅菌吸頭輕輕吹打 3 次混勻，冰浴 15 分鐘使質粒與細胞膜充分接觸，期間避免頻繁移液造成細胞機械損傷。

2. 儀器參數設置：啟動 Gene Pulser X2 電穿孔儀，進入原核細胞操作模式。首先使用電阻預檢功能，自動檢測電轉緩沖液離子強度，儀器根據 S699 菌株特性從內置數據庫調取預優化方案（初始推薦波形為指數波，電壓梯度設為 1.4-2.0 kV/cm，脈沖次數 1-3 次，間隔時間固定 2 秒）。支持手動微調參數，設置 3 個電壓水平（1.6、1.8、2.0 kV/cm）與 3 種脈沖次數（1、2、3 次），形成 9 組正交實驗組合。

3. 電轉操作流程：將混合液轉移至預冷電轉杯，確保電極間距均勻且無氣泡殘留。通過腳踏開關觸發電轉程序，10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形動態，包括電壓衰減曲線與膜通透性變化趨勢。電轉結束后，立即加入 950 μL 預冷無抗培養基，輕柔吹打后轉移至 2 mL 厭氧培養管，28℃靜置復蘇 3 小時（每 30 分鐘輕輕顛倒混勻，避免細胞沉淀）。

4. 轉化效率評估：取復蘇菌液 100 μL 與 200 μL 無菌玻璃珠混合，在含阿霉素的固體培養基表面均勻涂布，28℃倒置培養 72-96 小時。待菌落形成后，選取直徑＞1 mm 的單菌落計數，計算轉化效率（CFU/μg 質粒 DNA），每組實驗設置 5 個平行樣本，結果取平均值 ± 標準差。

結果與討論

感受態細胞制備工藝的關鍵影響因素

通過單因素實驗發現，洗滌次數對轉化效率有顯著影響：3 次洗滌可有效去除培養基中的蛋白殘留與代謝產物，使電轉時的脈沖能量更精準作用于細胞膜，相較于 2 次洗滌組，細胞存活率從 85% 提升至 91%（臺盼藍拒染法檢測）。離心速率優化結果顯示，5000 r/min 時細胞沉淀率達 98%，且細胞破損率僅為 3.2%，優于更高轉速下的機械損傷風險。此外，凍存過程中采用梯度降溫（-20℃→-80℃）可進一步穩定細胞膜結構，復蘇后細胞活性保持率較直接凍存法提升 15%。

電轉化參數的協同優化效應

實驗數據表明，波形選擇與電壓 - 脈沖組合存在顯著交互作用。針對 S699 菌株，指數波在跨膜電勢建立初期表現出更好的膜通透性調控能力，當電壓為 1.8 kV/cm、脈沖次數 2 次時，轉化效率達到峰值（3.5×10? CFU/μg），較傳統方波提升 32%。進一步分析發現，單次高電壓脈沖易導致細胞膜不可逆穿孔（細胞死亡率＞40%），而多次低能量脈沖組合（間隔 2 秒）可通過膜修復過程的動態平衡，在保證 DNA 攝入的同時將細胞死亡率控制在 15% 以內。Gene Pulser X2 的實時波形監控功能顯示，指數波的衰減斜率在 0.8-1.2 ms?1 區間時，DNA 遞送效率與細胞存活率達到最佳平衡。

儀器技術優勢對實驗可靠性的提升

電弧防護 3.0 系統在實驗中表現出的樣本保護能力，所有電轉過程均未出現電火花放電現象，避免了因局部過熱導致的 DNA 降解與細胞破裂。電阻預檢功能自動補償不同批次緩沖液的離子差異，使平行實驗的轉化效率 RSD（相對標準偏差）≤1.8%，顯著優于手動調節參數的傳統設備（RSD 約 18%）。此外，儀器支持的腳控觸發與單手操作設計，在處理厭氧環境樣本時大幅減少了污染風險，配合 96 孔板適配器（需單獨選購），可實現高通量電轉化實驗的標準化操作。

結論

研究通過系統性優化地中海擬無枝酸菌 S699 的感受態細胞制備工藝，結合 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀的核心技術優勢，成功建立了高效穩定的電轉化體系。該儀器的雙波協同技術精準匹配菌株膜特性，智能預優化系統顯著縮短參數摸索周期，電弧防護功能為珍貴樣本提供可靠保障，成為難轉染微生物基因操作的理想工具。

目前，Gene Pulser X2 已在超過多家實驗室驗證其在環境菌株改造、CRISPR 基因編輯等領域性能。針對地中海擬無枝酸菌等特殊菌株，廠家可提供定制化參數優化方案與免費技術培訓，助力科研團隊快速突破電轉化技術瓶頸。如需獲取本研究詳細操作手冊或儀器專屬報價，歡迎聯系威尼德技術支持團隊進行深度咨詢。

參考文獻

1. 張靜霞,王欣瑜,唐克慧.利福霉素類抗生素分析方法研究進展[J].中國抗生素雜志.2009,(10).

2. 丁曉明,張霓,田永強,等.利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體的基因置換/中斷系統[J].生物工程學報.2002,(4).DOI:10.3321/j.issn:1000-3061.2002.04.007 .

3. 鄭璞,王蕾,史朝輝.地中海擬無枝酸菌原生質體電融合及其在提高利福霉素SV發酵效價中的應用[J].中國抗生素雜志.2002,(5).DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.05.004 .

4. 李文華.完善地中海氏擬無枝菌酸菌U32遺傳操作系統的研究工作[D].2002.

5. 丁曉明.地中海氏擬無枝菌酸菌（Amycolatopsismediterranei）U-32遺傳操作系統的建立[D].2001.

6. Eva Wan,Jun Xu,Chang-Joon Kim,等.Identification of tailoring genes involved in the modification of the polyketide backbone of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei S699[J].微生物學通報.2005,151(8).